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      English

      食品微生物檢驗GB4789.4-2016 沙門氏菌檢驗及注意事項

      發布時間:2020-09-21      瀏覽次數:9815    分享:

      一、沙門氏菌生物學特性

            生物學特性:沙門氏菌屬是食源性細菌性腸胃炎的首要病原菌,屬于腸桿菌科,革蘭氏陰性無芽孢桿菌,營養需求不高,需氧或兼性厭氧。典型菌株多具有周生鞭毛、能運動(除雞瘟沙門菌和雞沙門菌外)、大部分菌株產H2S、能分解葡萄糖并產氣,最適培養溫度為37℃,最適pH 7.2~7.6。耐受膽鹽,在糞便、土壤、食品、水中可生存5個月至二年之久。

            血清型:沙門菌屬由兩個種組成:腸道沙門菌(S.enterica)和邦哥沙門氏菌(S.bongori)。目前已知沙門氏菌血清型有2500多種,

            流行學特征:引起食物中毒最常見的沙門氏菌包括鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌。而易引起沙門氏菌中毒的食品則有肉、蛋、乳類等。

      二、沙門氏菌的檢驗

      三、培養基原理解析

            1. 緩沖蛋白胨水(BPW)

            ?其成分中含有磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉,起緩沖液的作用;

            ?蛋白胨提供生長營養,有利于損傷沙門氏菌的復蘇。

            2. 四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)

            ?配方中硫代硫酸鈉和碘經氧化生成四硫磺酸鈉,它對大腸菌群有抑制作用,對沙門氏菌無影響(因沙門氏菌具有四硫磺酸酶,能分解四硫磺酸鈉,而大腸菌群沒有這種酶,故生長受抑制);

            ?碳酸鈣為緩沖劑,可使沙門氏菌不致因酸堿度改變面死亡。

            ?由于配方含碳酸鈣,因此,該培養基配置后的最終pH不在7.0±0.2,而是偏堿性。

      四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)

            3. 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

            ?蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求;乳糖是可發酵的糖類;亞硒酸氫鈉抑制革蘭氏陽性菌和非沙門氏菌的大多數革蘭氏陰性腸道菌;磷酸鹽是緩沖劑;L-胱氨酸為還原劑。

            ?使用過程中要注意SC培養基不穩定,配置時避免過度加熱。

      亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

            4. 亞硫酸鉍瓊脂培養基(BS)

            ?配方中亞硫酸鈉可與檸檬酸鉍銨生成亞硫酸鉍,抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群;硫酸亞鐵可產生硫化氫,并與鐵反應生成黑色沉淀。

            ?沙門氏菌在BS上的典型菌落特征:具有金屬光澤的棕色或黑色菌落。但有些菌株形成非典型菌落特征:灰綠色的菌落,周圍培養基不變。

            ?BS平板應制備后避光常溫保存,并在24h內使用。

      亞硫酸鉍瓊脂(BS)菌落特征

            5. HE瓊脂培養基

            ?配方中膽鹽、去氧膽酸鈉、溴麝香草酚蘭等成分可抑制革蘭氏陽性菌生長;酸性復紅作為酸堿指示劑的同時,也可抑制陽性菌,但對陰性腸道菌無抑制作用,選擇性較弱。硫代硫酸鈉可被細菌還原產生硫化氫,與檸檬酸鐵銨反應生成黑色硫化亞鐵。

            ?菌落特征:藍綠色或藍色,多數菌落中心黑色或全幾乎全黑色;有些菌株為黃色,中心黑色或幾乎全黑色。

      HE瓊脂菌落特征——鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028

            6. XLD瓊脂培養基

            ?配方中木糖、乳糖和蔗糖成分作為可發酵的碳源,除志賀氏菌外,其他大多數腸桿菌均能發酵木糖;沙門氏菌發酵木糖產酸,形成酸性環境有利于產生脫羧酶使賴氨酸脫羧,從而使培養基的pH值升高向堿性轉變;在堿性條件下,硫代硫酸鈉及檸  檬酸鐵銨成分與沙門氏菌產生的硫化氫反應是的菌落的顏色呈黑色;去氧膽酸鹽成分可抑制革蘭氏陽性菌的生長。

            ?菌落特征:菌落呈粉紅色,帶或不帶黑色中心,有些菌株可呈現大的帶光澤的黑色中心,或呈現全部黑色的菌落;有些菌株為黃色菌落,帶或不帶黑色中心。

      XLD瓊脂菌落特征——鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028

             7. 沙門氏菌顯色培養基

            ?蛋白胨和酵母膏粉提供碳氮源和微量元素;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養基的凝固劑;膽鹽抑制革蘭氏陽性菌;選擇性添加劑增強培養基的抑制雜菌的能力;混合色素分別與沙門氏菌和大腸菌群所對應的酶發生特異性反應,水解底物,釋放出顯色基團,在淡黃色平板上沙門氏菌產生品紅色的菌落,大腸菌群產生藍綠色的菌落。

      CRM004 沙門顯色培養基——鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028

            8. 三糖鐵瓊脂培養基

            ?蛋白胨、牛肉膏粉提供氮源、維生素、礦物質;乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發酵糖類,其產酸時通過酚紅指示劑測出,酸性呈黃色,堿性呈紅色;硫代硫酸鈉可被某些細菌還原為硫化氫,與硫酸亞鐵銨中的鐵鹽生成黑色硫化鐵;氯化鈉維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養基的凝固劑。

      三鐵塘

            9. 賴氨酸脫羧酶試驗培養基

            ?具有氨基酸脫羧酶的細菌,能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺)和二氧化碳,使培養基變堿,使指示劑顯示出來。

            ?結果判讀:陽性為試驗管為綠色-藍綠色,對照管變黃色; 陰性為試驗管和對照管均變黃色,或均不變色。

      賴氨酸脫羧酶試驗陽性

            10. 靛基質試驗

            ?某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。

            ?結果判讀:陽性為滴加靛基質試劑后液面立即變玫紅色;陰性為滴加試劑后不變紅色。

      靛基質試驗

            11. 尿素酶試驗

            ?具有尿素酶的細菌分解培養基中的尿素,產生大量的氨,使培養呈堿性,酚紅指示劑在pH6.8時呈黃色,pH8.1呈粉紅色。

            ?結果判讀:陽性為玫紅色; 陰性為淡橙紅色-淡黃色。

      尿素酶試驗

            12. 氰化鉀利用試驗

            ?氰化鉀是細菌呼吸酶系統的抑制劑,可與呼吸酶作用使酶失去活性,抑制細菌的生長,但有的細菌在一定濃度的氰化鉀存在時仍能生長,以此鑒別細菌.。

            ?結果判讀:陽性為試驗管和對照管都有生長變渾濁; 陰性為試驗管澄清不見生長,對照管生長渾濁。

      氰化鉀利用陰性結果

            13. 糖(醇)發酵試驗

            ?絕大多數細菌都能利用糖(醇)類作為碳源和能源,但是它們在分解糖(醇)的能力上有很大的差異,有些細菌能分解某種糖(醇)并產酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產酸不產氣。酸的產生可利用指示劑來斷定。

            ?(指示劑為溴甲酚紫)結果判讀:陽性為變黃色;陰性為紫色。

      甘露醇發酵試驗

            14. 沙門氏菌屬不同生化反應結果出現百分率

      實驗名稱

      反應結果

      沙門菌比例(%)

      三糖鐵發酵葡萄糖產酸

      陽性

      100

      三糖鐵發酵葡萄糖產氣

      陽性

      91.93

      三糖鐵發酵乳糖

      陰性

      99.24

      三糖鐵發酵蔗糖

      陰性

      99.5

      三糖鐵產硫化氫

      陽性

      91.6

      尿素(pH7.2)

      陰性

      99

      賴氨酸脫羧酶

      陽性

      94.65

      ONPG

      陰性

      98.44

      VP

      陰性

      100

      靛基質試驗

      陰性

      98.9

            15. 沙門氏菌判定表

      三糖鐵

      賴氨酸脫羧酶

      靛基質

      尿素(pH7.2)

      補充實驗

      O與H多價

      結果判定

      斜面

      底層

      硫化氫

      紅色

      黃色

      陽性

      陰性

      陰性

      無需補充

      均凝集

      沙門氏菌屬

      紅色

      黃色

      不產

      陽性

      陰性

      陰性

      ONPG陰性

      均凝集

      沙門氏菌屬

      黃色

      黃色

      陽性

      陰性

      陰性

      無需補充

      均凝集

      沙門氏菌屬

      黃色

      黃色

      不產

      陰性

      無需測試

      無需測試

      無需補充

      無需測試

      非沙門氏菌

      紅色

      紅色

      產/不產

      陽性/陰性

      無需測試

      無需測試

      無需補充

      無需測試

      非沙門氏菌

      ?在接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養基的同時,可直接接種蛋白胨水(供做靛基質試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養基,一定要注意是同一個菌落,這種實驗組合的優勢是可篩選掉更多的非沙門氏菌,減少后續工作量。

      ?上述結果判定僅適用于典型沙門氏菌,如出現非典型結果,應進行系統生化鑒定和血清學分型進行確認。

            16. 071740 沙門氏菌生化鑒定盒(接種鼠傷寒沙門氏菌的結果)

             17. EasyID 沙門氏菌生化鑒定盒(接種鼠傷寒沙門氏菌的結果)

      四、血清試驗

            血清學鑒定中的多價菌體(O)和多價鞭毛抗原鑒定是沙門氏菌鑒定的必做項目,血清學分型為選作試驗。實驗室必須配備沙門氏菌的多價菌體(O)和多價鞭毛(H)診斷血清。血清學試驗必須基于生化結果試驗的結果,不能單純以血清學實驗結果來報告最終。

      A-F “O”多價血清凝集                     A-F “O”多價血清不凝集

      五、沙門氏菌恒溫熒光核酸快速檢測

      六、沙門氏菌檢驗所需培養基試劑

      用途

      貨號

      名稱

      規格

      前增菌

      023130

      緩沖蛋白胨水(BPW)

        瓶(干粉)250g

      CP0680

      緩沖蛋白胨水(BPW)

        盒(袋裝)225 mL×10袋

      CP0290

      緩沖蛋白胨水(BPW)

        盒(瓶裝)225 mL×6瓶

      CP0560A

      緩沖蛋白胨水(BPW)

        盒(管裝)9 mL×20支

      023130P1

      緩沖蛋白胨水(BPW)

        瓶(顆粒)250 g

      二次增菌

      023030

      四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎(TTB)

        瓶(干粉)250g

      SR0040

      四硫磺酸鈉煌綠增菌液配套試劑

        盒(西林瓶)2×5支/盒

      CP0300

      四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)

        盒(管裝)10 mL×20支

      023040

      亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

        瓶(干粉)250g

      CP0050

      亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

        盒(管裝)10 mL×20支

      023040P1

      亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)

        瓶(干粉)250g

      平板分離

      023052

      亞硫酸鉍瓊脂(BS)

        瓶(干粉)250g

      023070

      HE瓊脂培養基

        瓶(干粉)250g

      CP0110

      HE瓊脂培養基

        盒(平板)90 mm×20

      029999

      木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD

       瓶(干粉)250g

      029999P1

      木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

       瓶(顆粒)250 g

      CP0180

      木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

       盒(平板)90 mm×20

      CRM004

      沙門氏菌顯色培養基

       1000 mL

      CP0560

      沙門氏菌顯色培養基平板

       盒(平板)90 mm×20

      生化鑒定

      022080

      三糖鐵瓊脂(TSI)

       瓶(干粉)250g

      CP0080

      三糖鐵斜面

       盒(管裝)20支

      022110

      蛋白胨水

       瓶(干粉)100g

      075240

      蛋白胨水

       盒(西林瓶)20支

      029230

      靛基質試劑

       10 mL×1支/盒

      023090

      尿素瓊脂培養基基礎

       瓶(干粉)100g

      029100

      40%無菌尿素溶液

       盒(西林瓶)2 mL×10支

      075150

      尿素(凍干)

       10支(凍干)+10支(無菌水)

      075330

      氰化鉀生長實驗管

       盒(西林瓶)20支

      075340

      氰化鉀對照管

       盒(西林瓶)20支

      生化鑒定

      075280

      賴氨酸脫羧酶培養基

       盒(西林瓶)20支

      075290

      氨基酸脫羧酶對照培養基

       盒(西林瓶)20支

      029110

      無菌石蠟油

      10 mL×1支

      075090

      山梨醇

       盒(西林瓶)20支

      075040

      甘露醇

       盒(西林瓶)20支

      075180

      β-半乳糖苷ONPG

       盒(西林瓶)20支

      075100

      衛矛醇

       盒(西林瓶)20支

      075140

      水楊素(水楊苷)

       盒(西林瓶)20支

      075190

      丙二酸鹽

       盒(西林瓶)20支

      HKI 02

      Easy ID沙門氏菌生化鑒定盒(不含三糖鐵)

      血清學實驗驗

      HM42

      沙門氏菌乳膠凝集試劑盒

       50 tests

      026050

      半固體瓊脂

       瓶(干粉)250g

      075350A

      半固體瓊脂

       盒(管裝)20支

      023118

      沙門氏菌鞭毛誘導軟瓊脂

       瓶(干粉)250g

      核酸快速檢測試劑盒

      KJD05L

      沙門氏菌核酸檢測試劑盒(恒溫熒光法)

       24測試/盒

      HANDY PALTE微生物測試片

      HP005

      沙門氏菌檢測片

       20片/包



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