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      English

      食品微生物檢驗GB4789.5-2012 志賀氏菌檢驗及注意事項

      發布時間:2020-11-18      瀏覽次數:9731    分享:

      一、志賀氏菌的生物學特性

      生物學特性:志賀氏菌屬細菌為革蘭氏陰性短桿菌,長約2~3μm,寬0.5~0.7μm,無芽胞,無莢膜,無鞭毛,有菌毛,不運動;需氧或兼性厭氧,對營養要求不高,在普通培養基(如營養瓊脂)上即能生長;最適生長溫度35~37℃,適宜pH為6.4~7.8。發酵糖類產酸不產氣(福氏和鮑氏志賀菌中的某些血清型偶可產生少量氣體)。分為4個群:A群(痢疾志賀氏菌)、B群(福氏志賀氏菌)、C群(鮑氏志賀氏菌)、D群(宋內氏志賀氏菌)。

      流行學特征:志賀氏菌產生強烈的內毒素(endotoxin,ET),是一種脂多糖和脂蛋白復合物,為志賀氏菌致病的重要致病因素。A群志賀氏菌Ⅰ型能產生一種毒性極強的細菌外毒素稱為志賀毒素(Shigatoxin,Stx),與感染者中毒性腹瀉、出血性腸炎、溶血性尿毒癥等嚴重并發癥的發生密切相關,其毒性可表現為神經毒性、細胞毒性和腸毒性。在我國以福氏和宋內志賀菌引起的菌痢最為常見。 病人和帶菌者是細菌性痢疾的傳染源,由于飲食從業人員的帶菌,可以使食品污染而造成食物型爆發。由于污水滲入供水系統,也常造成水型的爆發。

      二、志賀氏菌的檢驗

      三、培養基原理解析

      1. 志賀氏菌增菌肉湯培養基

      ?培養基中除胰蛋白胨、葡萄糖外,加入新生霉素作抑菌劑,并加入少量的吐溫80作增溶劑,以幫助樣品的充分分散。

      ?41℃厭氧培養有助于抑制其它雜菌生長。

      2. 麥康凱瓊脂培養基(MAC)

      ?利用膽鹽來抑制革蘭氏陽性細菌的生長;利用乳糖發酵,中性紅的顏色可把分解乳糖和不分解乳糖的細菌區分開。

      ?志賀氏菌呈無色菌落,半透明,光滑,濕潤,圓形,邊緣整齊或不齊。

      麥康凱瓊脂培養(MAC)

      3.木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽(XLD)瓊脂培養基

      ?脫氧膽酸鈉可以抑制革蘭氏陽性細菌和部分大腸桿菌,多數志賀氏菌不能發酵木糖,木糖的添加可將志賀氏菌與其它菌株區別開來,因此,志賀氏菌在XLD平板上呈現無色菌落,但少數發酵木糖的志賀氏菌在此平板上會被漏檢,XLD平板對宋內志賀氏菌亦有輕度抑制作用。

      ?志賀氏菌通常呈粉紅色至無色,半透明,光滑,濕潤,圓形,邊緣整齊或不齊菌落。

      木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽(XLD)瓊脂菌落特征

      4.志賀氏菌顯色培養基

      ?利用非志賀氏菌的特異性的酶,使其與酶底物結合形成不同顏色的菌落,而生化特性反應不活躍的志賀氏菌經22~28h培養后,則形成易于識別的白色-粉紅色(與培養基顏色相近)的菌落。

      ?志賀氏菌呈白色/清晰的菌落,大小約為1~3mm,周圍培養基變紅。

      5.三糖鐵瓊脂培養基

      ?該培養基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例為10:10:1,只能利用葡萄糖的細菌,葡萄糖被分解產酸使斜面先變黃,但因量少,生產的少量酸。因接觸空氣而氧化,加之細菌生長利用培養基中含氮物質,生成堿性產物,故斜面后來又變紅。底部由于厭氧狀態,酸類不被氧化,仍保持黃色。而發酵乳糖的細菌,則產生大量的酸,使整個培養基呈黃色。另外,因某些細菌能分解含硫氨基酸,生成硫化氫,硫化氫和培養基中的鐵鹽反應生成黑色的硫化亞鐵沉淀。

      三糖鐵

      6.靛基質試驗

      ?某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。

      ?結果判讀:陽性為滴加靛基質試劑后液面立即變玫紅色; 陰性為滴加試劑后不變紅色。

      靛基質試驗

      7.尿素酶試驗

      ?具有尿素酶的細菌分解培養基中的尿素,產生大量的氨,使培養呈堿性,酚紅指示劑在pH6.8時呈黃色,pH8.1呈粉紅色。

      ?結果判讀:陽性為玫紅色; 陰性為淡橙紅色-淡黃色。

      尿素酶試驗

      8.賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗

      ?具有氨基酸脫羧酶的細菌,能分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺)和二氧化碳,使培養基變堿,使指示劑顯示出來。

      ?結果判讀:陽性為試驗管為綠色-藍綠色,對照管變黃色; 陰性為試驗管和對照管均變黃色,或均不變色。

      賴氨酸脫羧酶試驗陽性

      9.糖(醇)發酵試驗

      ?絕大多數細菌都能利用糖(醇)類作為碳源和能源,但是它們在分解糖(醇)的能力上有很大的差異,有些細菌能分解某種糖(醇)并產酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和氣體(如氫、甲烷、二氧化碳等);有些細菌只產酸不產氣。酸的產生可利用指示劑來斷定。

      ?(指示劑為溴甲酚紫)結果判讀:陽性為變黃色; 陰性為紫色。

      甘露醇發酵試驗

      10.β-半乳糖苷酶

      ?某些細菌可產生b-半乳糖苷酶,能分解鄰硝基酚-b半乳糖苷(ONPG),生成黃色的鄰硝基酚。

      ?結果判讀:陽性為黃色; 陰性為不變色-淡黃色。

      ONPG生化管

      11.  葡萄糖銨試驗

      ?鑒別細菌利用銨鹽作為唯一氮源并分解葡萄糖的試驗。溴麝香草酚藍是指示劑,產酸時培養基由綠色變黃色。

      ?結果判讀:陽性為黃色; 陰性為綠色。

      葡糖糖銨利用試驗

      12.  西蒙氏檸檬酸鹽培養基

      ?細菌能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源,能在除檸檬酸鹽外不含其他碳源的培養基上生長,分解檸檬酸鹽生成碳酸鈉,使培養基變堿性。

      ?結果判讀:陽性為藍綠-藍色; 陰性為綠色。

      西蒙氏檸檬酸鹽培養基試驗

      13.  粘液酸鹽試驗

      ?某些細菌能利用粘液酸鹽,分解產酸,使培養基中的溴麝香草酚藍變黃色。

      ?結果判讀:陽性為黃色; 陰性為綠色-藍綠色。

      粘液酸鹽試驗

      四、志賀氏菌的生化鑒定

      生化反應

      A群:痢疾志賀氏菌

      B群:福氏志賀氏菌

      C群:鮑氏志賀氏菌

      D群:宋內氏志賀氏菌

      ?-半乳糖苷酶

      -a

      -a

      尿素

      賴氨酸脫羧酶

      鳥氨酸脫羧酶

      -b

      水楊苷

      七葉苷

      靛基質

      -/+

      (+)

      -/+

      甘露醇

      +c

      棉子糖

      甘油

      (+)

      (+)

      d

      注:+表示陽性;-表示陰性;-/+表示多數陰性;+/-表示多數陽性;(+)表示遲緩陽性;d表示有不同生化型。

      a痢疾志賀1型和鮑氏13型為陽性。

      b鮑氏13型為鳥氨酸陽性。

      c福氏4型和6型常見甘露醇陰性變種。

      ?附加生化鑒定

      ?由于某些不活潑的大腸埃希氏菌(anaerogenic E.coil.)、A-D(堿性-異型Alkalescens-D isparbiotypes)菌的部分生化特征與志賀氏菌相似,并能與某種志賀氏菌分型血清發生凝集。需要進一步做葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗(36℃培養24 h~48 h)。

      生化反應

      A群:痢疾志賀氏菌

      B群:福氏志賀氏菌

      C群:鮑氏志賀氏菌

      D群:宋內氏志賀氏菌

      大腸埃希氏菌

      A-D菌

       

      葡萄糖銨

      西蒙氏檸檬酸鹽

      d

      d

      粘液酸鹽

      d

      d

      注1:+表示陽性;-表示陰性;d表示有不同生化型。

      注2:在葡萄糖銨、西蒙氏檸檬酸鹽、粘液酸鹽試驗三項反應中志賀氏菌一般為陰性,而不活潑的大腸埃希氏菌、A-D(堿性-異型)菌至少有一項反應為陽性。

       

      五、志賀氏菌的血清診斷

      ?志賀氏菌屬沒有動力,所以沒有鞭毛抗原。志賀氏菌屬主要有菌體(O)抗原。菌體O抗原又可分為型和群的特異性抗原。

      ?一般采用1.2%~1.5%瓊脂培養物作為玻片凝集試驗用的抗原

      ?在玻片上劃出2個約1cm×2cm的區域,挑取一環待測菌,各放1/2環于玻片上的每一區域上部,在其中一個區域下部加1滴抗血清,在另一區域下部加入1滴生理鹽水,作為對照。

      ?再用無菌的接種環或針分別將兩個區域內的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min,并對著黑色背景進行觀察,如果抗血清中出現凝結成塊的顆粒,而且生理鹽水中沒有發生自凝現象,那么凝集反應為陽性。

      ?如果待測菌的生化特征符合志賀氏菌屬生化特征,而其血清學試驗為陰性的話,可挑取菌苔于1mL生理鹽水做成濃菌液,100℃煮沸15 min~60 min去除K抗原后再檢查。

      六、所需培養基試劑

      用途

      貨號

      名稱

      規格

      增菌

      023141

      志賀氏菌增菌肉湯

      瓶(干粉)250g

      SR0380

      志賀氏菌增菌肉湯配套試劑(新生霉素)

      盒(西林瓶)10支/盒

      CP0730

      志賀氏菌增菌肉湯(需加配套試劑)

      盒(袋裝)225 mL×10袋

      平板分離

      029999

      木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

      瓶(干粉)250g

      029999P1

      木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

      瓶(顆粒)250g

      CP0180

      木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽瓊脂(XLD)

      盒(平板)90 mm×20

      022144

      麥康凱瓊脂

      瓶(干粉)250g

      024076

      麥康凱瓊脂培養基平板

      盒(平板)90 mm×20

      CRM011

      志賀氏菌顯色培養基

      1000mL

      CRM011A

      志賀氏菌顯色瓊脂平板

      盒(平板)90 mm×20

      生化鑒定

      022080

      三糖鐵瓊脂(TSI)

      瓶(干粉)250g

      CP0080

      三糖鐵斜面

      盒(管裝)20支

      026050

      半固體瓊脂

      瓶(干粉)250g

      075350A

      半固體瓊脂

      盒(管裝)20支

      CP0150

      營養瓊脂

      盒(管裝)20支

      024089

      營養瓊脂平板

      盒(平板)90 mm×20

      022020

      營養瓊脂

      瓶(干粉)250g

      022020P1

      營養瓊脂(NA)

      瓶(顆粒)250g

      023090

      尿素瓊脂培養基基礎

      瓶(干粉)100g

      029100

      40%無菌尿素溶液

      盒(西林瓶)10支/盒

      生化鑒定

      075150

      尿素(凍干)

      盒(西林瓶)10支/盒

      075280

      賴氨酸脫羧酶培養基

      盒(西林瓶)20支/盒

      075270

      L-鳥氨酸脫羧酶培養基

      盒(西林瓶)20支/盒

      075290

      氨基酸脫羧酶對照培養基

      盒(西林瓶)20支/盒

      029110

      無菌石蠟油

      10 mL×1支

      075180

      β-半乳糖苷ONPG

      盒(西林瓶)20支/盒

      075140

      水楊素(水楊苷)

      盒(西林瓶)20支/盒

      075160

      七葉靈(七葉苷)

      盒(西林瓶)20支/盒

      075040

      甘露醇

      盒(西林瓶)20支/盒

      075230

      D-棉籽糖

      盒(西林瓶)20支/盒

      生化鑒定

      022110

      蛋白胨水(靛基質培養基,色氨酸肉湯)

      瓶(干粉)100g

      075240

      蛋白胨水(靛基質培養基,色氨酸肉湯)

      盒(西林瓶)20支/盒

      029230

      靛基質試劑

      10 mL×1支

      075840

      甘油發酵管

      盒(西林瓶)20支/盒

      075260

      葡萄糖銨

      盒(西林瓶)20支/盒

      023150

      葡萄糖銨培養基

      瓶(干粉)250g

      075200

      西蒙氏檸檬酸鹽

      盒(西林瓶)20支/盒

      022120

      西蒙氏檸檬酸鹽培養基

      瓶(干粉)250g

      075521

      粘液酸鹽測試肉湯

      盒(西林瓶)20支/盒

      075522

      粘液酸鹽質控肉湯

      盒(西林瓶)20支/盒

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