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      “菌落總數測定”標準解讀,適合新手學習,老手自查??!

      發布時間:2022-10-26    瀏覽次數:251

      菌落總數檢驗程序

      一、 稱樣:

      (1) 一般稱量25g,由于稱樣量較大,標準中對于稱樣的準確性未作出明確規定,微生物室常用稱樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g,一般遵循“宜多不宜少”的原則,即實際稱樣時可根據樣品情況稱取超出25g (如硬質糖果等,檢驗人員應依據樣品實際情況決定如何稱樣) ;

      (2) 對于部分食品添加劑已明確須稱取1.0g的,則須嚴格精確稱量。

      二、 樣品稀釋:

      (1) 固體或半固體:稱取25g樣品于均質袋中,加入已滅菌的生理鹽水225g,稍捏碎(特別是糕點/面包及其他淀粉制品),放入拍擊式均質器均質 1min,此時即制備成 1:10 的樣品勻液。以滅菌移液器吸取該液體至 9mL 滅菌生理鹽水試管中,換上新的滅菌移液器槍頭,緩緩吸取液體后反復吹打 2次,此時即制備成 1:100 的勻液,以此類推,制備10倍系列稀釋勻液。

      (2) 液體樣品:直接吸取原液進行檢驗,稀釋時可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。

      三、稀釋度的選?。?/span>液體樣品可直接取原液進行檢驗;固體或半固體則必須依據檢驗經驗,選取2-3個適宜稀釋度進行檢驗(一般樣品選取1: 10, 1: 100, 1: 1000三個稀釋度進行檢驗。若遇到不常做的樣品,可適當延長稀釋度至1: 100000 甚至1: 1000000)。

      四、質量控制:空白對照:分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對照。(若空白有菌落生長則該實驗無效)。

      五、平板計數瓊脂(PCA)滅菌條件為121℃、15min。一般情況下于500mL敞口錐形瓶(三角瓶)中配制400mL/瓶。

       六、有時樣品基質比較特殊,樣品勻液有細小的顆粒與菌落不易區分,此時可采用如下方法進行區分:

         (1)配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液(又稱紅四唑或紅四氮唑,簡稱TTC),高壓滅菌后避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為:121℃、20min;

         (2)待PCA瓊脂培養基冷卻至適宜傾注溫度時,無菌加入上述TTC溶液2mL,充分搖勻(此時PCA中TTC濃度為0.005%)。

       加入TTC的目的及注意事項:培養后,菌落被TTC染成紅色,而樣品顆粒不變色,方便計數;PCA中TTC的濃度不宜過高,否則會抑制微生物的生長,對實驗結果產生影響。(特殊情況下方添加TTC,常規實驗無須添加,特別是對于菌落數量較少的樣品不宜添加。方法來源依據為《化妝品衛生規范》中菌落總數測定相關章節)

      加TTC檢測菌落總數

      七、稀釋液:常采用0.85%氯化鈉溶液(生理鹽水),121℃、15min高壓滅菌后冷卻備用。

       八、傾注培養基時,根據對樣品污染情況的估計(同一類型樣品的微生物檢測經驗),若樣品有表面蔓延生長的可能性,則待第一次傾注的瓊脂凝固后,可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計數。

      九、水產品30±1℃培養72±3h;其它樣品36±1℃培養48±2h。注意:此處的“水產品”是指生魚片、魷魚干等未經深度加工的水產品。

      十、本標準的重難點為菌落計數及計算。


      除標準中已說明的要求外,有以下幾點需要注意:

         (1)菌落計數時,從低稀釋度的平板開始計數。若所有平板上的菌落數均小于30CFU,則須計數所有平板上的菌落數,但僅采用最接近30CFU的兩個平板的菌落數來計算最終菌落總數。


      以固體樣品舉例,菌落數選取、計算過程及結果修約如下:


         (2)當第一稀釋梯度一個板上菌落數高于30,另一個低于30,則依據標準應當以介于30-300之間的菌落數作為該稀釋梯度的菌落數。(存在爭議,實際遇到該類情況時應謹慎對待)

      以固體樣品舉例,菌落數選取、計算過程及結果修約如下:


         (3)若所有平板上的菌落數均大于30CFU,則只計數30-300CFU之間的平板上的菌落數,并采用這些數據,依據標準中給定的公式,進行最終菌落總數的計算,此時將大于300CFU的記為“多不可計”,以“TNTC”表示。

      以固體樣品舉例,根據標準中給定的公示,菌落數選取、計算過程及結果修約如下:


         (4)若所有稀釋度的平板菌落數都大于300,則不能所有都計為TNTC,必須將最高稀釋度的兩個平板上的菌落逐一地計數,再計算平均數,該平均數為該梯度的菌落總數,其余平板上的菌落數可記為TNTC。

      以固體樣品舉例,菌落數選取、計算過程及結果修約如下:


         (5)計算菌落總數時,須嚴格按照標準要求進行計算。

      特殊情況:

      ① 若所有平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數?!白畹拖♂尡稊怠辈⒉皇枪潭ú蛔兊?,與檢驗人員選取的稀釋度有關。如:某樣品多次檢驗后發現菌落總數較高,檢驗人員在梯度稀釋后取1:1000、1:10000、1:100000三個梯度的稀釋液傾注平板,最終所有平板上的均無菌落生長,則計算過程為<1×1000,最終結果為<1000CFU;若選取1:10、1:100、1:1000三個梯度的稀釋液傾注平板,均無菌落生長,則最終結果為<10CFU。因此,稀釋度的選擇對于結果存在較大影響,選擇時應謹慎。

      ② 最低稀釋度兩個平板只有一個平板上長了1個菌落,若為固體樣品且本次檢驗的最低稀釋倍數為1:10,此時計算過程為(1+0)/2×10=5,由于默認固體樣品最小檢出量為10CFU,故本次檢驗的菌落總數結果為10CFU。注意:對于該情況一直存在爭議,不同的檢驗人員可能做法不一,有人保留為5CFU,有人保留為10CFU,并無固定做法。(建議檢驗人員保持一貫做法,不要隨意更改)

      舉例如下:


      十一、對于水產品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數含量較高、限量值較大的食品類別,建議多增加稀釋梯度(可稀釋至10-4甚至10-5),避免稀釋度較低、濃度較大導致培養后平板上菌落蔓延、彌散而難以計數甚至無法計數。

      來源:環凱轉載于食品鑫焱公眾號

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